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纤维素酶(cellulase,CL)活性测定试剂盒说明书
时间:2017-07-19 点击次数:256

纤维素酶(cellulaseCL)活性测定试剂盒说明书

 

分光光度法 50 /24

 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:

 

CLEC 3.2.1.4存在于细菌、真菌和动物体内,能够催化纤维素降解,是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。

 

测定原理:

 

采用蒽酮比色法测定CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。

 

需自备的仪器和用品:

 

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

 

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

试剂一:液体 6mL×1 瓶,4保存;

 

试剂二:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;

 

试剂三:粉剂×1 瓶,4保存; 临用前加入 5mL 蒸馏水和 45mL 浓硫酸充分溶解待用。

 

样品测定的准备:

 

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

3、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤:

 

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 620nm,蒸馏水调零。

 

2、加样表(在 EP 管中依次加入下列试剂)

 

试剂名称

 

对照管

 

测定管

 

 

 

 

 

样本

 

100

 

100

试剂一(μL

 

 

 

180

试剂二(μL

 

740

 

740

蒸馏水(μL

 

360

 

180

37℃振荡反应 1h 后,90℃水浴 15min(盖紧,防止水分散失),冷却后

 

 

8000g 25℃离心 10min,取上清,得糖化液

糖化液 (μL)

350

 

350

试剂三 (μL)

650

 

650

 

混匀, 90℃水浴 10min(盖紧,防止水分散失),冷却,620nm 处蒸馏水调零,测定吸光值A,计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管设一个对照管。

CL 活力计算:

 

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 5.018x - 0.0462x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值。

 

2、血清(浆)CL 活力的计算

 

单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷V ÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

 

3、细胞、细菌和组织中 CL 活力的计算

 

1)按照蛋白浓度计算

 

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(V ×Cpr) ÷T

 

=39。8×(ΔA+0。0462) ÷Cpr

 

2)按样本鲜重计算

 

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

 

CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(W× V ÷V 样总) ÷T

 

=39。8×(ΔA+0。0462) ÷W

 

3)按细菌或细胞密度计算

 

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0。0462) ÷5。018×V 反总]÷(500×V ÷V 样总) ÷T

 

=0.0796×(ΔA+0.0462)

 

10001mg/mL=1000ug/mLV 反总:反应体系总体积,1.2mL V 样:加入样本体积,0。1 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,60 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500 万。

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