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中性蛋白酶活性测定试剂盒说明书
时间:2020-01-10 点击次数:94

可见分光光度法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

NP在一定的温度和中性 pH 条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

测定原理:

中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mLEP管和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 10 mL 试剂一,沸水溶解。

试剂四:粉剂×1 瓶, 4℃保存。临用前加 50 mL 蒸馏水溶解。

试剂五:液体×1 瓶,4℃保存。

标准品:液体×1 支,0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g组织,

加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,即粗酶液。

2. 血清或培养液:直接测定。

3. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500 万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1.分光光度计预热30min,调节波长到680nm,蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温 30min。

3.对照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂三,混匀后8000g, 4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入 1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为 A 对照管。

4.测定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂二,混匀后8000g, 4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入 1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为 A 测定管。 (注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5.空白管:取EP管,加入200μL 蒸馏水,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm 测定光吸收,记为A空白管。

6.标准管:取EP管,加入200μL标准品,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm 测定光吸收,记为A标准管。

注意:空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

1. 按照样本蛋白浓度计算

NP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol 酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min /mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T= 625×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

C标准品:0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定,需要另外测定;建议称取同样质量的样品,加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后,用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1 mL;T:催化反应时间(min),10min。

2.按照样本质量计算

NP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

NP活性(nmol/min/g)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷WC 标准品:0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;W:样品质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1 mL;V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。

3. 按照液体体积计算

NP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol 酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性(nmol/min/mL)=C 标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷V1÷T= 625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C 标准品:0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;V1:加入反应体系中血清或培养液体积,100μL=0.1 mL;T:催化反应时间,10min。

4. 按照细胞数量计算

NP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmo 酪氨酸为1个酶活单位。

NP 活性(nmol/min /104cell)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 625×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷细胞数量

C 标准品:0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5; V1:加入反应体系中粗酶液体积,100μL=0.1 mL;V2:粗酶液总体积,1mL;T:催化反应时间,

10min。

注意事项:

临用前配制的试剂配制好后 4℃保存,并且3天内使用完毕。

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