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辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书
时间:2019-04-01 点击次数:52

 

辅酶NADP(H)含量试剂盒说明书

 

微量法 100 /48 

 

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义

 

辅酶NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+ NADPH 含量测定可以计算 NADPNADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

 

测定原理

 

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+ NADPHNADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+ NADPH,从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品

 

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

 

酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存;

 

试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4 ℃保存一周;

 

试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;

 

试剂四:粉剂×1 支,℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;

 

试剂五:液体 3.6mL×1 支,℃保存;

 

试剂六:液体 30mL×1 瓶,℃保存;

 

试剂七:液体 50mL×1 瓶,℃保存。

 

NADP+ NADPH 的提取

血清(浆)中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 15~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 15~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

组织中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 15~10 的比例(建议取约 0.1g 组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 15~10 的比例(建议取约

 

0。1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

细胞或细菌中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加

 

入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加

 

入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤

 

1 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。

 

2 加样表( 1。5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

 

试剂名称(μL)

 

对照管

 

测定管

样本

20

20

试剂一

80

80

试剂二

30

30

试剂三

30

30

试剂四

30

30

试剂五

30

30

试剂六

200

 

混匀,室温避光静置 20min

试剂六

  

200

充分混匀,静置 5min 后,20000g25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

 

400

 

400

 

混匀,取 200μ转移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算A=A2-A1

 

注意事项

 

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

 

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

 

3、反应过程中注意避光。

 

4、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48  NADP+ NADPH。

 

NADP+ NADPH 含量的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

 

(一)NADP+含量的计算

1、血清(浆)中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL=[4。57× (A -0.062×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(A -0.062

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+ (nmol/mg prot=[ 4。57×(A -0。062×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(A -0.062÷Cpr

 

(2)按样本鲜重计算

 

NADP+ (nmol/g 鲜重)= [ 4.57×(A -0.062×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(A -0.062÷W

 

(3)按细菌或细胞密度计算

 

NADP+ (nmol/104 cell=[ 4.57×(A -0.062×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(A -0.062

 

(二)NADPH 含量的计算

 

1、血清(浆)中 NADPH 含量计算

 

NADPH 含量(nmol/mL=[7.2× (A -0.072×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (A -0.072

 

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算

 

NADPH (nmol/mg prot= [7.2× (A -0.072×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7。2× (A -0.072÷Cpr

 

(2)按样本鲜重计算

 

NADPH (nmol/g 鲜重)= [7.2× (A -0.072×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (A -0.072÷W

 

(3)按细菌或细胞密度计算

 

NADPH (nmol/104 cell= [7。2× (A -0.072×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (A -0.072V1:加入反应体系中样本体积,0.02mLV2:加入提取液体积,2mLV3:加入血清(浆)体积:0。1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量,g500:细胞或细菌总数,

 

500 万。

 

b. 96 孔板测定的计算公式如下

 

(一)NADP+含量的计算

1、血清(浆)中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL=[9.14× (A -0。062×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 182.8×(A -0.062

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算

 

NADP+ (nmol/mg prot=[ 9。14×(A -0。062×V1) ]÷(V1×Cpr)= 9.14×(A -0.062÷Cpr

 

(2)按样本鲜重计算

 

NADP+ (nmol/g 鲜重)= [ 9.14×(A -0.062×V1) ]÷(W×V1÷V2)=18。28×(A -0.062÷W

 

(3)按细菌或细胞密度计算

 

NADP+ (nmol/104 cell=[ 9.14×(A -0.062×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0366×(A -0。062

 

(二)NADPH 含量的计算

 

1、血清(浆)中 NADPH 含量计算

 

NADPH 含量(nmol/mL=[14。4× (A -0.072×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 288× (A -0.072

 

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

 

(1)按样本蛋白浓度计算

 

NADPH (nmol/mg prot= [14。4× (A -0.072×V1) ]÷(V1×Cpr)= 14。4× (A -0.072÷Cpr

 

(2)按样本鲜重计算

 

NADPH (nmol/g 鲜重)= [14.4× (A -0.072×V1) ]÷(W×V1÷V2)=28.8× (A -0.072÷W

 

(3)按细菌或细胞密度计算

 

NADPH (nmol/104 cell= [14.4× (A -0.072×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0。0576× (A -0.072V1:加入反应体系中样本体积,0。02mLV2:加入提取液体积,2mLV3:加入血清(浆)体积:0.1mLCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量,g500:细胞或细菌总数,

 

500 万。

 

注意:最低检测限为 1nmol/mL  1nmol/g 鲜重  0.01nmol/mg prot


 

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