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线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书
时间:2016-10-24 点击次数:402

线粒体复合体试剂盒说明书

 

分光光度法 25 管/24 样

 

测定意义

线粒体复合体又称琥珀酸-辅酶 Q 还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基 FAD 还原为 FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶 Q 生成还原型辅酶 Q,是呼吸电子传递链的支路。

测定原理

复合体的催化产物还原型辅酶 Q 可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在 605nm 有特征吸收峰,通过检测 2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:0。5 mL×1 支,-20℃保存;试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;试剂七:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g4℃离心 5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g4℃离心 10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体(此步可选做)。

5、步骤中的沉淀即为线粒体,加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于复合体酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 605nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)工作液的配制:临用前把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、100μL 试剂七和 800μL 工作液,立即混匀,记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,计算ΔA=A1-A2

复合体活力单位的计算

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体活力(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=113×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。复合体活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =0。226×ΔA V 反总:反应体系总体积,9.4×10-4 Lε2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2。1×104 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0。04 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500 万。

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