网站导航

技术文章

当前位置:主页 > 技术文章 > NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书
NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书
时间:2016-10-12 点击次数:361

NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书

 

分光光度法 50 管/48 样

测定意义:

NADKEC 2。7。1。23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化 NAD(H)ATP 或无机多聚磷酸

[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD 激酶在合成 NADP(H)

以及调节 NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。

测定原理:

NADK 催化 NAD+磷酸化,生成 NADP+NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH NADPH 通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过在 600 nm 下测定 MTT 的还原速度(吸光值的变化)可反映出 NADK 活性的大小。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存;试剂一:液体 20 mL×1 瓶,4℃保存;试剂二:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存;试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存;试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;试剂五:粉剂×1 瓶, -20℃保存;

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

 

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min 以上。

3、工作液的配制:在试剂三中加入 16mL 试剂一,充分混匀待用。工作液的配制:在试剂四中加入 22mL 试剂二,充分混匀待用。工作液的配制:在试剂五中加入 22mL 试剂二,充分混匀待用。

 

4、加样表

 

试剂名称(μL)

测定孔

 

 

样本

80

 

 

工作液

320

 

 

充分混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min,立即煮沸2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,室温离心 10min,取上清

上清液

100

 

 

工作液

440

 

 

工作液

440

 

 

加完试剂混匀后立即在 600nm 下测定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分钟 30 秒时的吸光值 A2,计算A= A2-A1

NADK 活性计算:

1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADKU/mg prot=[406×A - 0.004×V1]÷V1×Cpr÷T=135.3×A - 0.004÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADKU/g 鲜重)=[406×A - 0.004×V1]÷(W×V1÷V2÷T =135.3×A - 0.004÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADKU/104 cell=[406×A - 0。004×V1]÷500×V1÷V2÷T =0.271×A - 0。004V1:加入反应体系中样本体积,0。08mLV2:加入提取液体积,1mLT:反应时间,3minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

联系方式

邮件:jskangchina@163.com
地址:山东青岛市青大工业园韩海路
微信扫描关注我们:
在线客服 联系方式 二维码

服务热线

0532-58720157 0532-58967204

扫一扫,关注我们

欢乐生肖计划 重庆欢乐生肖走势图 重庆欢乐生肖走势图 秒速时时彩 大金彩票 欢乐生肖官方网站 欢乐生肖APP 秒速时时彩 欢乐生肖走势图 秒速时时彩官网